X射线揭示植物中意想不到的蛋白质功能

来自康奈尔大学和美国能源部(DOE)布鲁克海文国家实验室的一组科学家揭示了一种转运蛋白的意想不到的功能及其在植物调节机制中的作用。他们的研究发表在今年早些时候的《植物细胞》上，通过将必需的微量营养素包装到植物的可食用部分中，可以帮助减少人类矿物质缺乏症。

铁是人类必需的矿物质。铁除了是血红蛋白(一种将氧气输送到全身的红细胞蛋白)的关键成分之外，还有助于免疫系统并在认知功能中发挥作用。人体不能产生铁，因此必须经常食用。

菠菜等植物是铁的来源之一，但它们严格的调节机制可防止矿物质过度积累，因为它们在高浓度下对植物有毒。然而，科学家们一直在研究铁等矿物质的运输，以找到一种方法来超越这些调节机制并提高可食用植物的营养价值。

“这个故事很久以前就开始了，”康奈尔大学植物生物学家、负责这项研究的实验室负责人奥琳娜·瓦塔马尼克(OlenaVatamaniuk)解释道。大约十年前，Vatamaniuk和她的同事发表了一项令人惊讶的发现——一种名为寡肽转运蛋白3(OPT3)的转运蛋白负责在拟南芥模型植物中移动铁，而不是转运蛋白命名的寡肽(小肽)为了。

作为早期研究的一部分，密苏里大学的研究人员发现，减少OPT3会改变整个拟南芥植物中铁的分布;尽管叶子中铁含量丰富，但根部却显示出缺铁的迹象。这表明OPT3的作用与铁状态从叶子(称为芽)到根的传递有关。

这两项发现只是一个复杂故事的开始。

Vatamaniuk说：“在我们最新的研究中，我们希望利用我们对OPT3作用的了解来弄清楚转运蛋白如何与从芽到根的信号传导相关。”用超亮X射线观察植物内部是第一步，但OPT3还为科学家们带来了另一个惊喜。

拟南芥植物(如本研究中使用的植物)经常用于研究，因为它们繁殖迅速，并且具有完整绘制的较短基因组。图片来源：JosephRubino/布鲁克海文国家实验室

照亮植物化学

当科学家想要弄清楚蛋白质的作用时，他们通常会选择观察当大部分(如果不是全部)蛋白质从样品中去除时不会发生什么。去除所有OPT3蛋白对于本研究中使用的植物物种来说是致命的，因此研究人员对植物进行了基因改造，创造了OPT3转运蛋白丰度较低的“突变体”。

Vatamaniuk和她的同事想要了解突变植物和未改变植物之间铁在整个维管系统中的分布有何不同。研究人员对一种称为韧皮部的运输组织特别感兴趣，因为他们在近十年前就发现了OPT3将铁转移到该组织中。韧皮部通常将营养物质从营养物质高度集中的区域(称为源)输送到营养物质稀缺的区域(称为汇)。这与木质部维管组织形成对比，木质部维管组织将水和养分从根部输送到芽。

分析组织和细胞中铁分布的一种方法是使用共焦X射线荧光成像(C-XRF)，这是康奈尔大学光束线科学家ArthurWoll最近开发的一项技术。与传统的X射线荧光(XRF)成像一样，该技术使用明亮的X射线来揭示样品中不同化学元素的位置。但是，添加了沃尔设计的一种非常微小的特殊透镜(称为共焦光学器件)，为研究人员提供了深度灵敏度，以量化厚样品特定隔室内的元素浓度。康奈尔大学的研究人员通过一种称为纳米加工的工艺制造这些镜片。

为了在超小规模上应用这项技术，康奈尔大学的科学家将他们的样本带到了世界上最先进的X射线光源之一——国家同步加速器光源II(NSLS-II)。NSLS-II是美国能源部布鲁克海文实验室科学用户设施办公室，可产生比太阳亮100亿倍的光束。

Vatamaniuk实验室的研究员、本文的主要作者Ju-ChenChia解释说：“NSLS-II是唯一拥有足够明亮光束线的设施，能够为我们提供所需的分辨率。”“当时，没有其他设施能够为我们提供所需的单微米分辨率C-XRF图像。”

研究小组在NSLS-II的第一站是由AndrewKiss领导的亚微米分辨率X射线光谱(SRX)光束线。沃尔和基斯设置了一系列镜子，将X射线束聚焦到叶柄(植物连接叶子和茎的部分)的一个平方微米的区域。

X射线束和叶柄之间的相互作用发出荧光X射线信号，该信号通过仅一毫米远的纳米制造共焦光学器件传播，然后由硅漂移探测器记录。

“从技术角度来看，这确实具有挑战性，”基斯指出。除了使用小束斑尺寸外，研究人员还必须确保仅收集叶柄表面的X射线。从样本深处收集的X射线会降低分辨率并有效地模糊图像。

X射线荧光包含特征能量，就像样品中每种元素的指纹一样。Kiss和康奈尔大学的科学家对这些X射线进行了解码，以确定样本中包含哪些元素、这些元素的浓度以及它们的精确位置。

“在最初的论文中，我们提出OPT3对于将铁装载到韧皮部非常重要，”Chia解释道。“因此，我们认为，如果我们使用C-XRF分析突变植物维管组织，我们应该会在突变体的木质部中看到更多的铁，但在韧皮部中会看到更少的铁。”

研究人员准确地找到了他们想要的东西，但随后的分析让他们大吃一惊。

意外的发现

有些转运蛋白可以移动多个分子;有些转运蛋白可以移动多个分子。在植物中，铁通常与锌或锰一起运输。因此，在进行X射线荧光实验时，除了感兴趣的矿物之外，分析多种矿物的分布也是相当常见的做法。

“有时改变一种矿物质的浓度会导致植物中一系列其他浓度的变化，”Chia解释道。“铁、铜、锌和锰都是植物生长必需的矿物质，因此我们喜欢​​同时研究所有这些矿物质。”

尽管铜很重要，但它通常不与植物中的其他矿物质共享转运蛋白。这就是为什么当研究人员观察到突变体植物铜分布的变化与突变体铁分布相似时，他们感到特别震惊——这表明OPT3也将铜转运到韧皮部。

Vatamaniuk说：“如果我们没有将样本带到NSLS-II，我们永远不会考虑使用一台运输机在工厂中同时运输铁和铜。”他强调这些结果是多么出人意料。“这很不寻常。”

Kiss指出：“这项工作对于SRX光束线来说是一项伟大的技术成就。”“但这更好地展示了NSLS-II的专业知识和合作。”在这些实验中，Kiss和Woll与X射线荧光显微镜(XFM)光束线的负责人RyanTappero合作，Chia和她的同事进行了补充实验以证实他们的发现。

X射线视力

在XFM光束线上，康奈尔大学的科学家希望可视化元素在胚胎植物脉管系统中的内部分布，这些植物包含在成熟种子中。尽管切开种子并扫描其表面(就像科学家使用C-XRF研究叶柄一样)很诱人，但切开种子可能会导致元素重新分布。将脆弱的结构暴露在氧气中也可能导致化学反应，从而改变其元素组成。

“就像医生在不切开你的身体的情况下对你的身体进行CT扫描一样，我们使用XFM束线处的X射线对种子内部的矿物元素进行‘化学’CT扫描，而无需切开种子，”Tappero解释道。

医学CT扫描依靠旋转X射线源和探测器进行一系列曝光，计算机可以根据这些曝光重建内部结构的横截面图像。NSLS-II的科学家不旋转X射线束，因此他们对仪器进行编程，在X射线束中旋转种子样本，同时记录X射线荧光信号。

塔佩罗解释说：“种子的直径只有半毫米，这使得它们非常适合完整扫描。”当每个蛋形种子都被超亮X射线照射时，荧光信号会从种子中心辐射出来，并由硅漂移探测器进行测量。

第一次曝光后，仪器将样品旋转了不到一度，这样就可以从另一个角度再次对其进行攻击。仪器自动重复此过程，直到样品旋转完整360度。该技术称为X射线荧光计算机显微断层扫描(F-CMT)。

F-CMT横截面图像与传统XRF图像一样源自荧光信号;然而，科学家们使用额外的计算机重建技术来提供横截面视图。利用这些横截面图像来可视化胚胎植物中元素的内部分布，科学家们观察到与未改变的种子相比，突变种子的维管细胞中铁和铜的浓度较低。这些结果进一步证明OPT3转运蛋白同时转运铁和铜。

“我们将样本带到NSLS-II，这样我们就可以观察这种转运蛋白的生理学，并且我们必须带着位于这一切核心的重要拼图回到我们的实验室，”Chia指出。“一切都即将走到一起。”

OPT3故事的又一章

研究人员返回康奈尔大学实验室，深入研究突变植物的遗传学，以理解他们的新发现。通过一系列实验，他们发现铁和铜不仅共享转运蛋白，而且还在复杂的信号通路中相互作用，通过基因表达调节它们的摄取。

这项研究只是通过改变食用植物的营养成分来减轻人类矿物质缺乏的一步。Vatamaniuk和她的同事研究了拟南芥，这是一种常用于研究的非草植物，因为它繁殖速度快，并且基因组较短，且已完全绘制出来。研究人员现在可以利用他们的发现来研究这种转运蛋白在水稻、小麦或大麦等草类植物中的功能。

“植物的生理学可以调整转运蛋白的功能，”瓦塔马努克解释说。“因此，将这些知识应用于其他植物非常重要。我相信还会有更多的发现。”

“我想向NSLS-II的科学家表示感谢，因为他们确实帮助了我们，”她补充道。“合作的本质非常重要，但他们也非常友好和乐于助人。”

“我们有很多雄心勃勃的想法，”Chia说，“它们帮助我们将它们变为现实。”